豬腎細胞 PK-15

細胞介紹

從分離自新生的未閹割的豬的空腸的正常腸上皮細胞建立，該細胞系攜帶豬C型腫瘤病毒(PCOV)序列及其轉錄物，分別通過PCR和RT-PCR檢測。我們沒有確定這些病毒的感染方式，也不能排除病毒的分泌。在德國，這些病毒被分類為與人有關的BSL 1和與動物有關的BSL 2(TRBA 462)。然而，德國中央生物安全委員會(ZKBS)將這些病毒和受感染的細胞系BSL 2歸類為用于基因改造應用(參考文獻1。6790-10-65).

細胞特性

1） 來源：豬  腸(空腸)

2） 形態(tài)：上皮細胞樣  貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5）用途：僅供科研使用。

三、 細胞傳代操作步驟

A. 貼壁細胞傳代

1. 準備：吸棄舊培養(yǎng)基。

2. 沖洗：沿培養(yǎng)瓶側壁緩慢加入PBS等沖洗液，輕輕晃動后吸棄，去除殘留血清。

3. 消化：加入預熱的胰酶（如T25加1ml），輕輕晃動使胰酶覆蓋所有細胞。

4. 孵育：室溫消化約2分鐘（時間因細胞而異）。

5. 觀察：在顯微鏡下觀察，直至≥90% 細胞變圓、脫落。若未達到，可每30秒檢查一次。

6. 終止：當細胞充分解離后，立即加入兩倍胰酶體積的預熱的wan全培養(yǎng)基終止消化。

7. 吹打：用移液器輕輕吹打瓶壁，使細胞wan全脫落并分散成單細胞懸液。

8. 離心：將細胞懸液轉移至離心管，200 × g 離心 3-5分鐘，棄上清。

9. 重懸與接種：用少量新鮮wan全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，按適當比例稀釋后，接種到新的培養(yǎng)瓶中。

10. 培養(yǎng)：放入培養(yǎng)箱。若使用普通瓶蓋，務必旋松瓶蓋以利氣體交換。

B. 懸浮細胞傳代

1. 收集與離心：將細胞懸液全部轉移至離心管，1000 rpm 離心 5分鐘，棄上清。

2. 重懸：加入1-2ml新鮮wan全培養(yǎng)基，輕柔重懸細胞。

3. 接種：按1:2的比例將細胞懸液傳至新T25培養(yǎng)瓶，并補充總培養(yǎng)基量至5-8ml。

4. 培養(yǎng)：放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

四、 特殊問題處理：運輸中脫落的貼壁細胞

部分貼壁不牢的細胞在運輸中會脫落，屬正常現(xiàn)象，按以下步驟處理：

1. 收集：將瓶內所有培養(yǎng)基轉入無菌離心管，離心（1200rpm, 3-5min）棄上清。

2. 清洗：用PBS重懸細胞，再次離心（1200rpm, 3-5min）棄去PBS。

3. 消化：加入約1ml 0.25%胰酶，輕柔混勻（勿劇烈吹打），放入培養(yǎng)箱消化1-2分鐘。

4. 終止與分散：取出后輕輕吹打使細胞團分散，迅速加入3-5mlwan全培養(yǎng)基終止消化，離心（1200rpm, 3-5min）棄上清。

5. 重懸與接種：加入5mlwan全培養(yǎng)基重懸，按比例接種到新培養(yǎng)瓶/皿中。

6. 觀察：鏡下觀察。若細胞為單顆或僅有3-5個細胞的小團，可正常培養(yǎng)，待其貼壁生長。--細胞凋亡的早期形態(tài)學改變是核染色質濃聚、固縮,聚集在核膜周邊，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片，細胞膜將胞質和染色質斷片包裹，胞漿內形成多個膜結構尚完整的“小泡"及 “凋亡小體" (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。

       根據凋亡細胞固有的形態(tài)特征，至今為止，已經設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。

流式細胞技術

     流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結構的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產，右向角射光的強度與細胞結構的析射性、顆粒性（granu-larity）有關。

     細胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變如細胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。

     由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數的檢測結合起來才能準確地辨認凋亡細胞。

     細胞凋亡過程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。

    根據此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質比例等方法辨認凋亡細胞。

檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。

豬腎細胞 PK-15

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小鼠胰島β細胞株 Min6

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小鼠骨肉瘤成骨細胞 K7M2wt

小鼠乳腺癌細胞 EMT6

小鼠海馬神經元細胞 HT22

小鼠小腸內分泌細胞系 STC-1

小鼠乳腺上皮細胞 EpH4-Ev

小鼠肝細胞 AML12

小鼠膀胱癌細胞 MB49

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小鼠腎小球系膜細胞 SV40-MES-13

小鼠胚胎肝細胞 BNLCL.2

小鼠肥大細胞瘤細胞 P815

小鼠腎癌細胞 Renca

小鼠腦神經膠質母細胞瘤瘤株 G422

小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0

小鼠精原細胞系 GC-1spg

小鼠腎髓質細胞 mIMCD-3

小鼠前列腺癌細胞 RM-1

小鼠宮頸癌細胞 U14

小鼠卵巢癌細胞 ID8

小鼠皮下結締組織細胞 L-WRN

小鼠胰腺腺泡癌細胞 266-6

小鼠骨髓基質細胞　 OP9

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1

人子宮頸表皮癌細胞MS751 MS751

小鼠肝癌 H22

小鼠淋巴瘤細胞 EL4

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小鼠胰島內皮細胞 MS1

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中國倉鼠肺細胞CHL CHL

倉鼠肺細胞 V79

豬肺泡巨噬細胞 3D4/21

中國倉鼠卵巢細胞 CHO

雞淋巴瘤細胞 DT40

猴腎細胞 MARC145

鴨子胚胎成纖維細胞 Duckembryo

中國倉鼠卵巢細胞(懸浮 CHO-S

果蠅胚胎細胞S2 S2

豬腸上皮細胞 IPEC-J2

 豬鼻甲黏膜成纖維細胞 PT-K75

豬肺泡巨噬細胞 3D4/21

 豬腎細胞 PK-15