HepG2細(xì)胞培養(yǎng)攻略

HepG2細(xì)胞來源于一個(gè)15歲白人的肝癌組織。該細(xì)胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細(xì)胞能大容量培養(yǎng)，乙肝表面抗原陰性，對G418有抗性，對人生長激素有刺激反應(yīng)。

HepG2細(xì)胞廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)、外源性生物性異物的細(xì)胞毒性、乙型肝炎病毒感染機(jī)制、病毒培養(yǎng)等方面的研究。由于其與肝細(xì)胞具有相同的生物學(xué)活性，還被用于胰島素抵抗的研究。

細(xì)胞名稱：人肝癌細(xì)胞細(xì)胞簡稱：HepG2種屬來源：人組織來源：肝疾病特征：肝癌細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣生長特性：貼壁生長培養(yǎng)體系：MEM+10%FBS+1%Glutamax+1%NEAA+100mM Sodium Pyruvate+1%P/S傳代比例：1:2-1:4，每2-3天換液一次傳代周期：72-96 h培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%CO2，溫度：37℃凍存條件：60%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+30%FBS+10%DMSO，液氮儲存?zhèn)鞔何ヅ囵B(yǎng)液。用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1:4至1:6為宜，傳代期間培養(yǎng)液每周更換2次）注釋：該細(xì)胞表達(dá)3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶還原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。該細(xì)胞在有(英文名：gramoxone)的環(huán)境下*酶mRNA表達(dá)增加，ApoA-I mRNA 表達(dá)減少。

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)的*佳培養(yǎng)條件

HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇條件

1.1 復(fù)蘇溫度的選擇

細(xì)胞復(fù)蘇：快速將所凍存細(xì)胞40℃水浴搖床60轉(zhuǎn)/ min慢搖至其溶解，溶解后馬上轉(zhuǎn)入 37 ℃水浴箱，手工慢搖恒溫 2～3min復(fù)蘇 ,復(fù)蘇后 800 轉(zhuǎn)/ min 離心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基 ,混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板 ,每孔 1 ml，5%CO2溫箱 37℃培養(yǎng)。與傳統(tǒng) 37 ℃水浴方法復(fù)蘇后細(xì)胞存活率為 68.4% 相比較，先40℃溶解后再37℃恒溫方法復(fù)蘇的細(xì)胞存活率為85.7%，優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

1.2 復(fù)蘇用培養(yǎng)基的選擇使用RPMI-1640和DMEM兩種培養(yǎng)基對HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞結(jié)果在接種密度為1×104/c㎡、血清含量為15%時(shí)，經(jīng)6h培養(yǎng)后細(xì)胞開始貼壁，12h后大部分細(xì)胞貼壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例傳代。而用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在接種密度為1×104/c㎡、血清含量為20%時(shí)，經(jīng)6h培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁不明顯，但12h后部分細(xì)胞貼壁，24h后亦大部分細(xì)胞貼壁，且增值速度相對較慢，5天后可以按1:3的比例進(jìn)行傳代。以上結(jié)果說明，使用DMEM培養(yǎng)基既可以節(jié)省血清，細(xì)胞貼壁所用時(shí)間短、增殖速度快，并且傳代細(xì)胞培養(yǎng)也使用DMEM培養(yǎng)基，使用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，避免了配制不同培養(yǎng)基所帶來的麻煩，因此在HepG2細(xì)胞復(fù)蘇中推薦使用DMEM培養(yǎng)基。
1.3 復(fù)蘇時(shí)的接種密度研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種密度為1×104/cm2，血清含量為20%時(shí), 細(xì)胞24h后大部分貼壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例傳代；當(dāng)接種密度大于1×104/c㎡和（或）血清含量少于20%時(shí), 細(xì)胞表現(xiàn)為貼壁困難, 出現(xiàn)進(jìn)行性退化; 當(dāng)接種密度小于1×104/c㎡ 血清含量為20%時(shí), 細(xì)胞24h后大部分貼壁, 但增殖速度明顯減慢, 約7d后才可按1:3比例傳代。

消化酶及消化時(shí)間的選擇

如果用EDTA+胰酶的消化能力太強(qiáng)，消化時(shí)間不好把握，傳代消化后細(xì)胞死亡較多；單用EDTA消化能力太弱，消化時(shí)間太長且不易將細(xì)胞消化*；用PBS將細(xì)胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆蓋細(xì)胞約30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞消化適度。將待傳代細(xì)胞不用PBS洗滌和用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后分別用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進(jìn)行消化（消化液用量為蓋滿瓶底），觀察時(shí)間為30秒、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不用PBS洗滌的細(xì)胞分別用上述兩種酶消化，10分鐘后細(xì)胞仍然消化不*。用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后的細(xì)胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化時(shí)，分別經(jīng)3分鐘、1分鐘和0.5分鐘能*消化好細(xì)胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進(jìn)行消化時(shí)，*消化好細(xì)胞約需3分鐘、1.5分鐘、1分鐘。二者的結(jié)果相符。

根據(jù)上述結(jié)果可知，在進(jìn)行HepG2細(xì)胞的消化時(shí)，先用pH7.2的PBS洗滌三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分鐘效果比較好。

另一種推薦使用的消化方法如下：用1×PBS將細(xì)胞洗滌2次 再加入適量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）覆蓋細(xì)胞約20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）。